天主教和景教在元末明初的大動亂中消聲匿跡之後，又過了將近二百年的時間，才有天主教宣教士再次嘗試去中國宣教。
在十五、十六世紀，歐洲發生了天翻地覆的變化。過去，歐洲無論在工商業還是文化教育上，都落後于中國。但從十五世紀開始，歐洲在新興手工業和海外貿易的帶動下，經濟文化開始蓬勃發展。西班牙、葡萄牙和意大利的航海家，先後到達印度和美洲，並成功地完成環球航行，這使他們在貿易以及開拓海外殖民地方面佔了先機。發端自意大利的「文藝復興」運動，帶動了歐洲學術文化的空前繁榮。當時的歐洲文明正是一派欣欣向榮的局面，並隨著他們的遠洋商隊、探險隊、海外殖民者和宣教士，把歐洲的科技、文化和宗教帶到了全世界。
葡萄牙人率先繞過非洲南端的「好望角」，開通了從歐洲到印度的航道。接著，他們進而通過馬六夾海峽，開通了到達中國的航道。在十六世紀初期，他們已經常常在中國南方的港口出現。但當時的中國政府不歡迎任何外來訪客，凡來往外人一律驅逐。可是，不久之後，大約是1553年前後，葡萄牙商人運用賄賂手段，使當地政府準許他們在澳門上岸「晾曬貨物」。然而，從1557年開始，他們進一步在澳門建造住宅，長期居留。從此，澳門成了歐洲商人和傳教士進入中國內地的跳板。
天主教宣教士緊跟著歐洲商人和探險家的腳步，來到中國南方口岸。耶穌會修士沙勿略(FrancisXavier)于1542年到達果阿(Goa)，他抱定心志要把天主教傳遍整個東亞地區。1549年，他赴日本開展宣教工作。在那里，他了解到日本文化的源頭在中國，更加強了他去中國宣教的熱心。他甚至認為，假如中國歸向天主教，日本就必定會追隨其後，成為天主的子民。1551年，沙勿略返回果阿，和他的一些朋友和同工準備去中國的行程。1552年，他從印度出發去中國，並且找到一位受過天主教教育的中國人隨行擔任翻譯。他到達中國外海的一個稱為上川(音譯，ShangCh-uan)的島嶼之後，就開始招集一些當地青少年，教導他們天主教的基本教義。可惜的是，就在他想方設法準備進入中國內地的時候，卻患上重病，並且不久便去世了，使他向中國人傳教的大計劃功虧一簣。
十六世紀下半葉，葡萄牙人在澳門建立了永久性據點。與此同時，西班牙也在菲律賓發展他們的勢力。這其間，曾有一些天主教宣教士試圖從菲律賓或者澳門進入中國，但都不成功。直到意大利耶穌會修士羅明堅(MichaelRoggierius)于1579年奉命來到澳門之後，情況 發生了重大的轉變。他一到達，就開始學習中國的「官話」(Mandarin)，而不是澳門當地的方言－廣東話。因為，他已經了解到，要去中國內地宣教，不學好這種中國的儒生和全國官員所通用的語言是不行的。
羅明堅多次試圖進入內地，但除了短暫地訪問過幾次廣州之外，他的努力在明朝閉關鎖國政策面前，一次又一次地踫了壁。同時，他在學習漢語上，也遇到了巨大的困難。他甚至找不到一位願意教他中文的老師。據說由于他在遭遇到許多挫折之余，有一次站在窗前，面對中國大陸，悲痛地喊著說:「岩石啊，岩石，你何時 能開啟呢？！」
果然，「岩石」終于開啟了。1583年，又有兩位耶穌會修士來到澳門，作羅明堅的同工。其中的一位，就是大名鼎鼎的利瑪竇(MatteoRicci)。正是由于他的工作， 使天主教在中國的宣教事業真正開創了一個新的時代。
利瑪竇的宣教活動
利瑪竇(MatteoRicci)于1552年出生于意大利的馬奇拉達市(Macerata)一個貴族家庭。他自幼就是一個聰穎過人的學生。他父親要他去羅馬學習法學，準備將來作律師，然而他卻加入了耶穌會，作了修士，並決心去海外宣教。他于1577年被差遣赴遠東地區，于1582年到達澳門。一到那里，他便立刻開始學習中國官話(國語)。
就在他到達澳門的第二年，他和羅明堅(MichaelRuggerius)一起在廣東肇慶市找到了一個固定的立足點。雖然明朝對外國人入住內地的限制仍未放松，但是由于羅明堅曾為當地官員處理涉外事務做翻譯，深得賞識，因而特許他在城內居住。他們最初雖然沒有隱瞞自己的信仰，但也沒有公開他們的宣教意圖， 是說他們對中華文明仰慕已久，因而來此學習中國的典章文化。他們帶來了世界地圖，向來訪者指出歐洲的國家在那里，有時也送一些鐘表之類的小禮品，以吸引人們的好奇心。等他們認識了一些當地儒生和官員後，便進一步和他們探討學問，並向他們介紹西方的學術文化，這樣慢慢地把話題引到宗教信仰方面來。
在這里，利瑪竇繼續學習中文，並深入研究中國的經典著作。不到一年，他已經把四書譯成了拉丁文。他研究中國典籍的目的，就是想多多了解中國人的思想和信仰，以便尋找一個向中國人傳教的適當切入點。
有趣的是，他們開始以為中國的和尚和他們自己在西方的身份相當，都是職業宗教人士、僧侶，都不結婚，所以在初次進入內地時，特意穿上袈裟，剔了光頭，裝扮成和尚的模樣。後來 發現，和尚在當時中國社會的地位並不是很高的，反而是儒生在社會上享有更高的地位，進可為官為宦，管理國家和地方政務；退則成為紳士，仍然是一鄉一鎮的領袖人物。于是，他們便脫下袈裟，改穿當時儒生的服飾，以便贏得民眾的尊敬和儒生、官吏的接納。
他們的這一宣教策略是植根于耶穌會，甚至整個天主教的傳統之中的。自從第三世紀康士坦丁把天主教尊為羅馬帝國國教，並強制國民改信該教以來，天主教就處處以上層統治者為主要著力點，力促一國一族自上而下地改變信仰，歸入教皇的名下。羅明堅和利瑪竇爭取儒生認同的目的，就是因為看到他們掌握著通往高層統治階級的鑰匙， 有靠著他們， 能一步步地向上攀登，最終接近中國的皇室。而一旦使皇室了解了天主教的信仰，就有可能逐漸感化他們，並從他們中間產生出中國的「康士坦丁大帝」來。這不僅僅是他們的如意算盤，他們也為達成那個看似遙遠的目的而做出了不懈的努力，並取得了相當的成功。
在他們結識的一些官員幫助下，他們于1585年去內地旅行，並一度到達杭州。1588年，羅明堅返回歐洲，不久即去世，中國的宣教工作便完全由利瑪竇負責。第二年，他和他的同事被逐出肇慶，但他們又在潮州建立了據點。他于1594年進一步深入內地，一直到了南京，但不幸被逐，卻在江西省的南昌落下腳。1599年，利瑪竇首次進入北京，但未能找到落腳點， 好回到南方，在南京找到了住處。在那里，他認識了幾位真正對天主教教義感興趣的儒生，其中就有中國天主教史上舉足輕重的人物－徐光啟(PaulHsu)。徐光啟全家信奉天主教之後，對他家鄉的普通群眾產生了很大影響，而他的故鄉徐家匯也就成了天主教在中國的最古老、勢力最大的根據地。
1601年，利瑪竇的長期努力有了結果－他終于成功地進入北京，並被準許居留下來。由于他對中國和西方學術文化的廣博知識以及他對中華文明所表現的認同和敬仰，他很快就成了京城里儒生和大小官員最喜歡結交的人物。據說有很多儒生，其中甚至有翰林學士，都改奉天主教了。1610年，在徐光啟的大力協助下，耶穌會修士們又在上海建立了新的宣教據點。然而，也就是在這一年，利瑪竇在北京病逝，並被埋葬在皇城內某個太監家的後院里。
利氏雖然死了，生前甚至未能見到中國的皇帝－他心目中的「東方康士坦丁大帝」，但他對天主教在中國的影響是極其巨大的。他開闢的宣教工場，他所推行的宣教策略，以及他對中國文化所作的研究和解析，都成了後來的宣教工作不可缺少的資源和指引。他和徐光啟等人所翻譯的大量西方科技、數學、地理、水利、工程和人文學術方面的文獻，也給中國的知識界帶來了新知識、新思想和新方法，直接或間接地促進了中國學術文化的進步。對與天主教來講，最重要的是利瑪竇為其宣教事業打開了通往中國內地，通往明朝首都北京的門戶，直接造就了第一代中國信徒，並建立了潮州、南昌、南京、上海和北京的永久性宣教據點。他的功勞應該說是非常了不起的。
明末清初的天主教宣教活動
利瑪竇(MatteoRicci)于1610年在北京去世之後，耶穌會的宣教工作並未因此而受到任何影響，羅馬教廷委任另一位在華宣教的耶穌會修士，來自意大利西西里地區的洛拔蒂(NicoloLogobardi)接替利瑪竇的職務。從1610年到1613年間，又有六位耶穌會傳教士被差派來華。1615年，來自法國的耶穌會修士金尼閣(NicholasTrigault)從中國返回歐洲，向各天主教國家的王室貴族宣傳他們在遠東地區的輝煌成就，取得了一筆固定的資助，使耶穌會在中國的宣教事業有了財政上的保障。
在1606年，因著利瑪竇的推薦，熊三拔(SabbatinodeUrsis)被派來華，協助主管天文歷算的「欽天監」修訂朝廷的歷法。此事並未因利瑪竇的去世而發生變化，反而更因西歐歷算的精確，加上徐光啟等人的大力保舉而受到明廷的器重，于1611年委派熊三拔主持歷法的修訂。從這時起，直到1644年清軍入關建立滿清皇朝為止，除了1616年至1622年間因範禮安(AlphonsusVagnoni)被禮部懷疑與「白蓮教」之亂有牽連而招致對天主教的短暫逼迫之外，耶穌會在中國的宣教事業保持了不斷壯大的態勢。
在這期間，也有西班牙和葡萄牙的天主教宣教士，特別是方濟格會(Franciscans)和多明我會(Dominicans)修士，多次從菲律賓經由澳門等地進入中國內地，但很少有像耶穌會那樣成功建立永久性居點的例子。
從1620至1629年，又有十九位耶穌會宣教士來到中國，使天主教在中國各地都建立起了宣教的根據地，甚至遠在內陸的西安府都有了天主教教會。就在這時，熊三拔于1620年去世後，鄧玉函(JoannesTerrentius)接替他的職位。可惜，這位意大利天文學家伽利略(Galileo)的朋友未能為中國的天文歷算作出太大的貢獻。他在接掌「欽天監」後不久便謝世，由湯若望(JohnAdamSchallvonBell)接替他的工作，同時也成為天主教宣教士中最有威望的領袖人物。
這些耶穌會宣教士的工作是卓然有成的。據史家記載，明朝末期中國的天主教信眾人數大幅增加，單是在明朝宮廷內就達到540之眾，其中包括後妃、皇族、宦官和王公大臣。此外，他翻譯介紹的西方科技和學術著作，也使中國知識分子接觸到了當時西歐最先進的學術文化和科學成就。例如，除了利瑪竇和徐光啟等人的著作和譯作外，熊三拔著有泰西水法六卷，後由徐光啟收入農政全書；金尼閣所著奇器圖說，由王征翻譯成中文；鄧玉函編著崇禎歷書100卷，後來收入清朝編纂的四庫全書，改名為新法算書；湯若望編著的古今交食考、渾天儀說、西洋測日歷、遠鏡說、測食說、西洋新歷法書等等，對于豐富中國知識分子的思想觀念，促進中國科技和學術文化的進步，起到了積極的作用。
清軍入關之後，在那場改朝換代的大動蕩中，天主教的勢力雖然難免遭受一些沖擊，卻沒有像景教在唐末或元末那樣遭遇到滅頂之災。相反，隨著清朝統治地位的確立和穩固，耶穌會在華宣教工作很快便恢復起來，並且繼續成長。湯若望雖然曾幫助明廷鑄造鐵炮，用以抗拒清軍，清廷似乎並不怪罪他，順治皇帝還延用明朝的做法，讓他仍舊主持「欽天監」天文歷法的修訂工作。後來，為了表示對其工作的賞識和對其學術成就的推崇，順治皇帝給湯若望和他遠在意大利的父母都封了爵位，而且在皇宮里面賜予土地，以建造住宅和教堂。這次所造的教堂，便是北京城里歷史最悠久的天主教教堂，至今仍完好保存的「南堂」。